МОУ «Куровская средняя общеобразовательная школа № 1»

Возбудители жизни

(опыты, доказывающие свойства ферментов)

Естественно-научная секция (биология)

Работу выполнила

ученица 9 А класс

Зининой Римма.

Руководитель: учитель биологии

Щукарева Любовь Николаевна.

2008 – 2009 учебный год

Содержание

I.Введение …………………………………………………………………………………………2

II.Основная часть

1. Теоретическая часть

1.1.Общее положение………………………………………………………………………………………..3

1.2.Классификация ферментов и характеристика некоторых групп………………….4

1.3.Номенклатура ферментов…………………………………………………………………………..4

1.4..Строение ферментов ………………………………………………………………………………..4

1.6.Свойства ферментов…………………………………………………………………………………..5

2. Практическая часть. (Лабораторный практикум)

«Определение свойств ферментов»……………………………………………………………….7

2.1 Действие слюны на крахмал (1 вариант)…………………………………………………….7

2.2 Действие слюны на крахмал (2 вариант)…………………………………………………….7

2.3Опыт с картофелем……………………………………………………………………………………8

2.4 Действие амилазы на крахмал……………………………………………………………………8

2.5 Термолабильность ферментов……………………………………………………………………8

2.6 Действие активаторов а активность амилазы слюны……………………………….9

2.7 Свойства ферментов…………………………………………………………………………………9

2.8 Действие желудочного сока на белок…………………………………………………………9

Дополнительные опыты, которые можно провести при наличии предложенных реактивов………………………………………………………………………………11

III. Заключение………………………………………………………………………………………………..13

IV.Литература………………………………………………………………………………………………….14

V.Приложения………………………………………………………………………………………………..15

. 

«Все эти вещества играют огромную роль, они обусловливают собой те процессы, благодаря которым проявляется жизнь, они и есть в полном смысле возбудители жизни»

Русский физиолог И. П. Павлов

ВВЕДЕНИЕ

«Ферменты (от латинского слова fermentum – закваска) – белки, которые обладают каталитической активностью и характеризуются очень высокой специфичностью и эффективностью действия. Все процессы в живом организме — дыхание, пищеварение, мышечное сокращение, фотосинтез и другие – осуществляются с помощью ферментов. Ферменты находятся во всех живых клетках и составляют большую часть всех их белков. Они во много миллионов раз ускоряют самые разнообразные химические превращения, из которых складывается обмен веществ. Под действием различных ферментов составные компоненты пищи: белки, жиры и углеводы – расщепляются до более простых соединений, из которых затем в организме синтезируются новые макромолекулы, свойственные данному типу» Вот всё, что я знала о ферментах и поэтому решила расширить свой кругозор, собрав информацию и проделав ряд опытов, доказывающих свойства ферментов. Моя работа состоит из двух частей: теоретической и практической.

Такие полезные ферменты

Задумывались ли вы когда-нибудь, почему на входе в желудочно-кишечный тракт все такое разное, а на выходе все однообразно одинаковое? И куда делась та еда, которую вы поглощали?

Процесс переваривания пищи можно сравнить с раздеванием, причем раздевают сразу несколько рук. Одна тянется к шляпе, другая развязывает галстук, третья расстегивает пуговицы… Для каждой пищи — «своя рука», свой фермент.

Свое название ферменты получили от латинского слова «fermentatio», что означает «брожение». Уже в Древнем Египте люди использовали на практике реакции брожения при варке пива и выпечке хлеба. Гомер описывал свертывание молока в присутствии млечного сока фигового дерева. В дальнейшем обнаружилось, что все проявления жизни обусловлены наличием ферментов. Русский физиолог И.П.Павлов считал их возбудителями жизни: «Все эти вещества играют огромную роль, они обусловливают собой те процессы, благодаря которым проявляется жизнь, они и есть в полном смысле возбудители жизни».

За что же ферментам такой почет? Дело в том, что большинство реакций в организме в их отсутствии протекало бы настолько медленно, что сами эти реакции были бы бесполезны. Причем действуют ферменты в очень малых дозах. Так, 1 грамм фермента пепсина способен расщепить 50 килограммов яичного белка, 1 грамм кристаллического ренина заставляет свернуться 72 тонны молока.

Биологические катализаторы

В основе всех жизненных процессов лежат тысячи химических реакций. Они идут в организме без применения высокой температуры и давления, т.е. в мягких условиях. Вещества, которые окисляются в клетках человека и животных, сгорают быстро и эффективно, обогащая организм энергией и строительным материалом. Но те же вещества могут годами храниться как в консервированном (изолированном от воздуха) виде, так и на воздухе в присутствие кислорода. Возможность быстрого переваривания продуктов в живом организме осуществляется благодаря присутствию в клетках особых биологических катализаторов – ферментов.

Ферменты — это специфические белки, входящие в состав всех клеток и тканей живых организмов, играющие роль биологических катализаторов. О ферментах люди узнали давно. Еще в начале прошлого века в Петербурге К.С. Кирхгоф выяснил, что проросший ячмень способен превращать полисахарид крахмал в дисахарид мальтозу, а экстракт дрожжей расщеплял свекловичный сахар на моносахариды — глюкозу и фруктозу. Это были первые исследования в ферментологии. Хотя на практике применение ферментативных процессов было известно с незапамятных времен (сбраживание винограда, сыроварение и др.).

Общие положения

Через ферменты реализуется генетическая информация, и осуществляются все процессы обмена веществ и энергии в живых организмах. Все процессы в живом организме – дыхание, пищеварение, мышечное сокращение, фотосинтез и другие – осуществляются с помощью ферментов. Ферменты находятся во всех живых клетках и составляют большую часть всех их белков. Они во много миллионов раз ускоряют самые разнообразные химические превращения, из которых складывается обмен веществ.

Уже во рту во время пережевывания пищи под влиянием фермента амилазы сложного сахара, в частности крахмал, начинают разлагаться на менее сложные. Это работа в дальнейшем будет продолжена в кишечнике ферментами карбогидразами. В желудке и кишечнике разложению с участием пепсина, трипсина, химотрипсина подвергаются белки пищи. Жиры разлагаются на глицерин и карбоновые кислоты ( или их соли ) под влиянием ферментов, называемых липазами. Все эти реакции разложения протекают по одному принципу: разрывается определенная химическая связь в молекуле белка, углевода или жира, и освободившиеся валентности используются для присоединения групп ОН^— и иона Н⁺ из молекул воды. Происходит процесс гидролиза. Для молекулы белка эту реакцию можно представить так:

—R₁ — CO— NH ―R₂ ― + HOH = ― R₁COOH + NH₂ — R₂ —

Пепсин, химотрипсин, принимающие участие в пищеварении, могут служить примером ферментов, в которых активная группа является частью молекулы белка.

Пища в желудке подвергается расщеплению под действием ферментов. Главным ферментом желудочного сока является пепсин, который активизируется в присутствии HCI и расщепляет белки. Кроме пепсина, желудочный сок содержит липазу, химозин и желатиназу. Желатиназа расщепляет белок соединительной ткани – желатин. Липаза расщепляет жиры, но действует она лишь на эмульгированные жиры (например, жир молока, который взвешен в виде мельчайших капелек). Химозин вызывает свертывание молока и содержится, по-видимому, в желудочном соке в течение небольшого периода после рождения. Желудочный сок не содержит ферментов, расщепляющих углеводы.

Количество и состав желудочного сока изменяются в зависимости от состава пищи. Выделение сока начинается через 5-9 минут после приема пищи. Больше всего выделяется при приеме мяса, меньше – хлеба и еще меньше – молока.

Действие некоторых ферментов легко наблюдать в опыте. Так, фермент каталаза значительно ускоряет разложение перексида водорода Н₂О₂ на воду и кислород. Это жизненно важная реакция, так как пкроксид водорода образуется в результате обмена веществ в клетке и сам по себе оказывает на клетку вредное действие. Каталаза содержится почти во всех клетках животных и растительных организмов.

Ферменты бывают простыми или сложными белками, в состав которых наряду с белковым компонентом (апоферментом) входит небелковая часть – кофермент. Многие коферменты оказались витаминами или их производными. Белковая часть и небелковый компонент в отдельности лишены ферментативной активности, но, соединившись вместе, они приобретают характерные свойства фермента. Эффективность действия ферментов определяется значительным снижением энергии активации катализируемой реакции в результате образования промежуточных фермент-субстратных комплексов. Присоединение субстратов происходит в активных центрах, которые обладают сходством только с определенными субстратами, чем достигается высокая специфичность (избирательность ) действия ферментов. Настоящее время структура активных центров целого ряда ферментов расшифрована. Высокая специфичность действия ферментов связана с особенностями структуры их активных центров – она идеально соответствует строению субстрата.

.

Классификация ферментов

и характеристика некоторых групп

По первой в истории изучения ферментов классификации их делили на две группы: гидролазы, ускоряющие гидролитические реакции, и десмолазы, ускоряющие реакции не гидролитического распада. Затем была сделана попытка разбить ферменты на классы по числу субстратов, участвующих в реакции. В соответствии с этим ферменты классифицировали на три группы. 1. Катализирующие превращения двух субстратов одновременно в обоих направлениях: (А+В)С+D. 2. Ускоряющие превращения двух субстратов в прямой реакции и одного в обратной: (А+В)С. 3. Обеспечивающие каталитическое видоизменение одного субстрата как в прямой, так и в обратной реакции: А+В.

Одновременно развивалось направление, где в основу классификации ферментов был положен тип реакции, подвергающейся каталитическому воздействию. Наряду с ферментами, ускоряющими реакции гидролиза (гидролазы), были изучены ферменты, участвующие в реакциях переноса атомов и атомных групп (феразы), в изомеризации (изомеразы), расщеплении (лиазы), различных синтезах (синтетазы) и т.д. Это направление в классификации ферментов оказалось наиболее плодотворным, так как объединяло ферменты в группы не по надуманным, формальным признакам, а по типу важнейших биохимических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности любого организма. По этому принципу все ферменты делят на 6 классов.

Номенклатура ферментов

Примерами тривиальной номенклатуры могут служить названия таких ферментов, как пепсин (от греч. пепсис – пищеварение), трипсин (от греч. Трипсис – разжижаю) и папаин (от названия дынного дерева Carica papaja, из которого он выделен). По действию все эти ферменты являются протеолитическими, т. е. ускоряют гидролиз протеинов (белков). Характерное название было дано группе окрашенных внутриклеточных ферментов, ускоряющих окислительно-восстановительные реакции в клетки, — цитохромы (от лат. сitos – клетка и chroma – цвет).

Наибольшее распространение получила рациональная номенклатура, согласно которой название фермента составляется из названия субстрата характерного окончания –аза. Она была предложена более столетия тому назад, в 1883 г. Э. Дюкло – учеником Л. Пастера. Так, фермент ускоряющий реакцию гидролиза крахмала, получил название амилаза (от греч. липос – жир), белков (протеинов) – протеаза, мочевины – уреаза (от греч. уреа – мочевина) и т.п.

Когда методами аналитической химии были достигнуты известные успехи в расшифровке химической природы простетических групп, возникла новая номенклатура ферментов. Их стали именовать по названию простетической группы, например, геминфермент (простетическая группа – гем), пиридоксальфермент (простетическая группа – пиридоксаль) и т. п.

Строение ферментов

По строению ферменты могут быть однокомпонентными, простыми белками, и двухкомпонентными, сложными белками. Во втором случае в составе фермента обнаруживается добавочная группа небелковой природы.

В разное время возникли различные наименования белковой части и добавочной группы в двухкомпонентных ферментах. Все они до сих пор употребляются в литературе, например:

Фермент в целом Белковая часть Добавочная группа

Симплекс Ферон (носитель) Агон (активная группа)

Холофермент Апофермент Кофермент

Свойства ферментов

Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Вместе с тем биокатализаторы характеризуются рядом специфических качеств, тоже вытекающих из их белковой природы. Эти качества отличают ферменты от катализаторов обычного типа. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения pH среды, специфичность и, наконец, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.

Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоких значениях к денатурации белка и снижению католических функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрата, что ведет к усилению катализа.

Зависимость каталитической активности фермента от температуры выражается типичной кривой. До некоторого значения температуры ( в среднем до 5О^оС ) каталитическая активность растет, причем на каждые 10^оС примерно в 2 раза повышается скорость преобразования субстрата. В то же время постепенно возрастает количество инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части. При температуре выше 50^оС денатурация ферментного белка резко усиливается и, хотя скорость реакций преобразования субстрата продолжает расти, активность фермента, выражающаяся количеством превращенного субстрата, падает.

Детальные исследования роста активности ферментов с повышением температуры, проведенные в последнее время, показали более сложный характер этой зависимости, чем указано выше: во многих случаях она не отвечает правилу удвоения активности на каждые 10^оС в основном из-за постепенно нарастающих конформационных изменений в молекуле фермента.

Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурным оптимумом.

Температурный оптимум для различных ферментов неодинаков. В общем, для ферментов животного происхождения он лежит между 40^о и 50^оС, а растительного – между 50^о и 60^оС. Однако есть ферменты с более высоким температурным оптимумом, например, у папаина (фермент растительного происхождения, ускоряющий гидролиз белка) оптимум находится при 8О^оС. В то же время у каталазы (фермент, ускоряющий распад H₂O₂ до H₂O и O₂) оптимальная температура действия находится между 0^о и -10^оС, а при более высоких температурах происходит энергичное окисление фермента и его инактивация.

Зависимость активности фермента от значения pH среды была установлена свыше 50 лет назад. Для каждого фермента существует оптимальное значение pH среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне pH среды поблизости от нейтральной точки. В резко кислой или резко щелочной среде хорошо работают лишь некоторые ферменты.

Переход к большей или меньшей (по сравнению с оптимальной) концентрации водородных ионов сопровождается более или менее равномерным падением активности фермента.

Влияние концентрации водородных ионов на каталитическую активность ферментов состоит в воздействии ее на активный центр. При разных значениях pH в реакционной среде активный центр может быть слабее или сильнее ионизирован, больше или меньше экранирован соседними с ним фрагментами полипептидной цепи белковой части фермента и т. п. Кроме того, pH среды влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного комплекса и продуктов реакции, оказывает большое влияние на состояние фермента, определяя соотношение в нем катионных и анионных центров, что сказывается на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, так как определенная третичная структура белка-фермента необходима для образования фермент-субстратного комплекса.

Специфичность – одно из наиболее выдающихся качеств ферментов. Его свойство было открыто еще в прошлом столетии. Когда было сделано наблюдение, что очень близкие по структуре вещества – пространственные изомеры (α — и β- метилглюкозиды) расщепляются Ио эфирной связи двумя совершенно разными ферментами.

Таким образом, ферменты могут различать химические соединения, отличающиеся друг от друга очень незначительными деталями строения, такими, например, как пространственное расположение метоксильного радикала и атома водорода при 1-м углеродном атоме молекулы метилглюкозида.

По образному выражению, нередко употребляемому в биохимической литературе, фермент к субстракту, как ключ к замку. Это знаменитое правило было сформулировано Э. Фишером в 1894 году исходя из того, что специфичность действия фермента предопределяется строгим соответствием геометрической структуры субстрата и активного центра фермента.

В 50-е годы нашего столетия это статическое представление было заменено гипотезой Д. Кошланда об индуцированном соответствии субстрата и фермента. Сущность ее сводится к тому, что пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается в момент их взаимодействия друг с другом, что может быть выражено формулой «перчатка – рука». При этом в субстрате уже деформируются некоторые валентные связи, и он, таким образом, подготавливается к дальнейшему каталитическому видоизменению, а в молекуле фермента происходят конформационные перестройки. Гипотеза Кошланда, основанная на допущении гибкости активного центра фермента, удовлетворительно объясняла активирование и ингибирование действия ферментов и регуляцию их активности при воздействии различных факторов. В частности, конформационные перестройки в ферменте в процессе изменения его активности Кошланд сравнивал с колебаниями паутины, когда в нее попала добыча ( субстрат ), подчеркивая этим крайнюю лабильность структуры фермента в процессе каталитического акта.

В настоящее время гипотеза Кошланда постепенно вытесняется гипотезой типохимического соответствия. Сохраняя основные положения гипотезы взаимоиндуцированой настройки субстрата на фермент, она фиксирует внимание на том, что специфичность действия ферментов объясняется в первую очередь узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе. Между этой частью субстрата и субстратным центром фермента возникают многочисленные точечные гидрофобные взаимодействия и водородные связи.

Практические работы

«Определение свойств ферментов»

Лабораторная работа № 1. Действие слюны на крахмал (1 вариант)

Цель работы: Показать способность слюны переваривать углеводы.

Материалы и оборудование: крахмальный клейстер (1% водный р-р), 5% — спиртовой раствор йода, 2% р-р HCI, 4 пробирки, штатив для пробирок, водяная баня, спиртовка, воронка, пипетка.

Ход работы:

1.Собрали в пробирку небольшое количество слюны и разбавили ее водой в соотношении 1:2.

2.В каждую пробирку (№1-4) налили по 1 мл слюны.

3.Слюну в пробирке №2 предварительно нагрели на спиртовке до кипения и охладили , в пробирке №3 – подкислили, добавили 1-2 капли 2%-го раствора HCI.

4.Во все пробирки налили по 2 мл крахмального клейстера, пробирки встряхнули.

5.Пробирки №1-3 поместили на водяную баню (37 ^оС), а пробирку №4 – в стакан со льдом.

6.Через 10 мин к содержимому всех пробирок добавили по 1-2 капли р-ра йода.

7.Отметили, какие изменения произошли в пробирках. Результаты наблюдений записали в таблицу.

№ пробирки

Содержимое пробирки	Температура, оС	Окраска содержимого пробирки
1	2 мл крахмального клейстера +1 мл слюны	37оС	Не изменилась
2	2 мл крахмального клейстера + 1 мл прокипяченной слюны	37оС	синяя
3	2 мл крахмального клейстера + 1 мл подкисленной слюны	37оС	синяя
4	2 мл крахмального клейстера + 1 мл слюны	0оС	синяя

Лабораторная работа № 2. Действие слюны на крахмал (2 вариант)

Цель работы: показать, что ферменты слюны способны расщеплять крахмал.

Материалы и Оборудование: накрахмаленный бинт, нарезанный на куски длинной 10 см, вата, спички, блюдце, аптечный йод (5%-й), вода.

Ход работы:

1.Подготовили реактив на крахмал – йодную воду. С этой целью в блюдце налили воду и добавили несколько капель йода (аптечный 5%-й спиртовой раствор) до получения жидкости цвета крепко заваренного чая.

2.Намотали на спичку вату, смочили ее слюной, а затем этой ватой со слюной написали букву на накрахмаленном бинте.

3.Расправленный бинт зажали в руках и подержали его некоторое время, чтобы он нагрелся (1-2мин).

4.Опустили бинт в йодированную воду, тщательно расправив его.

Результат: Участки, где остался крахмал, окрасились в синий цвет, а места, обработанные слюной, останутся белыми, так как крахмал в них распался до глюкозы, которая под действием йода не дает синего окрашивания.

Вывод: Известно, что крахмал с йодом дает интенсивное синее окрашивание, по которому нетрудно узнать, где он сохранился. При обработке крахмала ферментами слюны он разрушается, если ферменты активны. В этих местах крахмала не остается, поэтому они не окрашиваются йодом и остаются светлыми.

Лабораторная работа № 3. Опыт с картофелем

Цель работы: 1)выяснить, есть ли в клубнях картофеля ферменты.

2)Доказать, что ферменты имеют белковую природу.

Материалы и оборудование: кусочки сырого и вареного картофеля, пипетка, пероксид водорода Н₂О₂.

Ход работы:

1.Нанесли с помощью пипетки несколько капель на поверхность сырого и вареного картофеля.

2.Наблюдаем «вскипание» пероксида водорода на поверхности сырого картофеля.

Вывод: В клетках сырого картофеля под влиянием фермента пероксидазы происходит реакция разложения пероксида водорода с выделением кислорода, вызывающего «вскипание»:

Н₂О₂ ↔ Н₂О + [О]; [О] + [О] → О₂↑.

Подтверждением того, что ферменты имеют белковую природу, служит отсутствие «вскипания» на поверхности вареного картофеля, так как при варке под влиянием высокой температуры происходит денатурация белков и ферменты, как и другие белки, теряют свою активность.

Лабораторная работа №4. Действие амилазы на крахмал

Цель работы: Выяснить наличие обмена восстановительными свойствами.

Приборы и материалы:5пробирок, раствор крахмала 0.5%, несколько капель слюны, раствор йода, раствор NaOH и CuSO_4.

Ход работы:

1.В 5 пробирок наливаем по 2-3мл 0.5%-ного раствора крахмала.

.Быстро прибавляем, начиная от 1-ой пробирки к 10-ой,по 2-3 капли слюны.В первую пробирку сразу вносим каплю 0.1%-ного раствора I_2, в остальные пробирки раствор I₂ добавляют с интервалами через 10-30 секунд.

Наблюдаем: Желтое окрашивание в пробирках. Через некоторое время в первых пробирках окраска стала менее интенсивной, чем в 4 и 5.

Вывод: гидролиз закончен.

2. Затем проводим реакцию Троммера.

Пробирку с продуктами реакции подогреваем – йод улетучивается. Прибавляем 4-5 капель 10%-ного раствора NaOH и 5-7 капель 7%-ного раствора CuSO_{4. .} Содержимое пробирок нагреваем до кипения_.

Наблюдаем: Выпадает желтый (красный) осадок CuOH ( Cu₂O + H₂O),

Вывод: глюкоза обладает восстановительными свойствами.

Лабораторная работа №5. Термолабильность ферментов.

Материалы и оборудование:2 пробирки, несколько капель слюны, вода, раствор крахмала 0.5%, раствор йода.

Ход работы: 1.В две пробирки наливаем по 5 капель слюны и по 1мл Н₂О. Одну пробирку с раствором слюны кипятим в течении 2 минут, другую – не кипятим.Добавляем по 10 капель 0.5% раствора крахмала и перемешиваем.

2.Через 5-10 минут проводим реакцию с йодом на крахмал.

Наблюдаем: В пробирке, которую не нагревали, при добавлении I₂ – синее окрашивание.(реакция на крахмал). А в пробирке которую нагрели при добавлении I₂ – желтое.

Вывод: Фермент слюны разрушился при кипении.

Лабораторная работа №6. Действие активаторов на активность амилазы слюны.

Материалы и оборудование: 3 пробирки, раствор крахмала 0.5%, раствор CuSO₄ 1%, раствор NaCI 1%, несколько капель слюны, раствор йода.

Ход работы:

1. В 3 пробирки наливаем по 1мл 0.5% раствора крахмала.

2. В первую пробирку прибавляем 2 капли 1%-ного раствора CuSO₄, во вторую – 2 капли 1%-ного раствора NaCI, третью – оставляют контрольной.

3.В каждую пробирку вносим по 5 капель слюны.

4. Через 5-10 минут добавляем по 1 капле раствора йода.

Наблюдаем: Различная окраска проб: в 1-ой – темно-коричневая во 2—ой – синяя в 3-й – коричневая

Через 5 минут окраска меняется: в 1-ой – коричневая (цвет заварки) во 2—ой – бледно-желтая в 3-й — желтая

Вывод: Окраска обуславливается степенью гидролиза крахмала.

Лабораторная работа №7. Свойства ферментов

1.Гидролиз крахмала под действием фермента и кислоты.

Ход работы:

1.Отмерем цилиндром 20-30мл дистиллированной воды и сольем ее в стаканы. Воду из стаканов берем небольшими порциями для ополаскивания рта в течении 1-2 минуты.

2.Эти порции воды со слюной сливаем в чистый стакан. Операцию ополаскивания повторим 3-4 раза с тем чтобы объем собранной жидкости составлял 40-50мл.

3.Собранную жидкость профильтруем через вату, пользуясь фильтратом для постановки опытов.

4. В три пробирки нальем по 3-4 мл раствора крахмала. В первую пробирку добавим 1 мл дистиллированной воды, во вторую 1 мл раствора соляной кислоты, в третью – 1 мл слюны.

5 Содержимое первой и третьей пробирок перемешаем и поставим в водяную баню при 38^оС, а вторую пробирку поставим в кипящую водяную баню.

6.Через 18-20 минут вынем пробирки из бани, охладим.

7.Проделаем качественные реакции на пробы из каждой

пробирки с йодом и гидроксидом меди (2) на крахмал и глюкозу.

№ пробирки

Субстрат	Катализаторы	окрашивание
1	крахмал	вода	синее
2	крахмал	Соляная кислота	бледно-желтое
3	крахмал	Амилаза слюны	желтое

Лабораторная работа № 8. Действие желудочного сока на белок

Цель работы: Показать способность желудочного сока переваривать белки.

Материалы и оборудование: Хлопья белка куриного яйца, полученного при кипячении ½ белка куриного яйца в 0.5л Н₂О, 4 пробирки, штатив для пробирок, водяная баня, Mg, спиртовка, желудочный сок, 0.5 % раствор NaON, воронка, пипетка.

Ход работы:

1. Пронумеровали пробирки (1-4). В каждую из них налили по 1мл желудочного сока.

2.Желудочный сок в пробирке №2 предварительно нагрели до кипения и охладили, в пробирке №3 – нейтрализовали 0.5%-ным раствором NaON (3-5 капель).

3.Во все пробирки добавили небольшое количество приготовленного белка.

4. Пробирки несколько раз встряхнули и поместили №1-3 на водяную баню (37^оС); №4 – в стакан со льдом.

5. Через каждые 8 10 минут содержимое пробирок взбалтываем.

6. Через 30 минут отметим, какие изменения произошли с белком.

Результаты наблюдения запишем в таблицу.

№ пробирки

Содержимое пробирки	Температура, оС	Результаты
1	Белок + 1мл желудочного сока	37	Содержимое стало прозрачным
2	Белок + 1мл прокипяченного желудочного сока	37	Раствор мутный
3	Белок + 1мл нейтрализованного желудочного сока	37	Раствор мутный
4	Белок + 1мл желудочного сока	0	Раствор мутный

Вывод: Белки расщепляются под воздействием ферментов желудочного сока, которые действуют лишь при определенной температуре и в кислой среде.

Влияние различных факторов на активность каталазы

Опыт№1. Зависимость активности каталазы от рН

1. В пробирку№1 нальем 1 мл воды, а в пробирку№2 – 1 мл щелочи (NaOH), в пробирку №3 – 1 мл кислоты (HCl)

2. Определим активную кислотность (рН) среды с помощью универсальной индикаторной бумаги. В пробирке№1 рН=7 (нейтральная среда), а в пробирке №2 – рН=9 (щелочная среда), рН=3 (кислая среда).

Пробирка № 1	Пробирка № 2	Пробирка №3
Время	30 мин.	4ч. 30 мин.	5 ч.

3. Вывод: в нейтральной среде реакция идет интенсивнее, т.е. проявляется зависимость активности фермента от рН среды.

Опыт№2. Зависимость активности каталазы от температуры.

1.Нальем в три пробирки по 5мл Н₂О₂ и 1 мл картофельного сока, содержащего каталазу.

2. Поместим эти пробирки в водяные бани с температурой 20⁰С,40⁰С и 80⁰С.

3. Наблюдаем за временем и интенсивностью протекания реакции. Окончание реакции – прекращение выделения пузырьков газа.

Пробирка№1	Пробирка№2	Пробирка№3
Температура	200	400	800
Время	24 мин. 16 сек.	7 мин. 4 сек.	10 мин. 30 сек.
Интенсивность	Интенсивность реакции невелика	Интенсивная реакция	Реакция практически не идет

4. Вывод: Как и при реакциях неорганических веществ, мы здесь наблюдаем повышение скорости реакции с повышением температуры (пробирка№1,№2), но это возможно здесь лишь до определенного предела. С повышением температуры выше 40⁰ С начинается замедление реакции. Это связано с белковой природой фермента (с повышение температуры начинается процесс денатурации).

Опыт№3. Зависимость активности каталазы от концентрации.

1. К 5мл Н₂О₂ добавляем в пробирку№1 – концентрированный сок картофеля; в пробирку№2 – разбавленный в 5 раз сок картофеля.

2. Наблюдаем в пробирке№1 бурную реакцию (30 сек.), выделение газа; а в пробирке№2 газ почти не выделяется, реакция идет менее интенсивно (2 мин.)

3. Вывод: С повышением концентрации каталазы скорость реакции увеличивается.

Опыт№4. Зависимость активности каталазы от концентрации субстрата.

1. В пробирку №1 нальем 1 мл Н₂О₂ — 33% и 1 мл сока картофеля; в пробирку №2 нальем 1 мл Н₂О₂ — 3% и 1 мл сока картофеля.

2. Наблюдаем за интенсивность протекания реакции. В пробирке№1 пенообразование и выделение пузырьков, идет быстрее, чем в пробирке №2.

3. Вывод: Чем выше концентрация субстрата, тем активнее идет реакция.

Дополнительные опыты, которые можно провести при наличии предложенных реактивов

Опыт №1.

Ход работы:

1. Получение сахарозы.

Навеску 0.5г пекарских дрожжей наносят тонким слоем на стекло и подсушивают. Затем растирают дрожжи в порошок в ступке для разрушения клеточных стенок микроорганизмов, добавляют 5-кратный объем Н₂О и центрифугируют. Центрифугат служит источником фермента сахаразы.

2. Определение субстратной специфичности ферментов.

В 2 пробирки наливают по 1мл 0.5 % раствора крахмала (субстрат) и добавляют в первую 0.5мл слюны, разведенной в 5 раз водой (источник амилазы), а во вторую – 5 капель вытяжки из дрожжей (источник сахаразы). В две другие пробирки наливают по 1мл 0.5 %-ного раствора сахарозы (субстрат), затем в первую пробирку добавляют 5 капель вытяжки из дрожжей (фермент сахараза), а во вторую – 0.5мл слюны, разведенной в 5 раз водой (фермент амилаза). Пробы помещают в водяную баню на 5-10 минут при 37^оС. Затем в пробирки с крахмалом добавляют 0.1 %-ного раствора I₂ и отмечают окрашивание. В пробирках с сахарозой проводят пробу Троммера на глюкозу.

Опыт №2

Специфичность действия ферментов (амилазы).

Ход работы:

В одну пробирку прилейте 3-4мл раствора сахарозы, а в другую -3-4мл раствора крахмала. В каждую из них прилейте по 3-4мл разбавленной слюны, хорошо перемешайте содержимое пробирок и поставьте в водяную баню при 38-40^оС . После 10 мин испытайте содержимое пробирок на восстановление гидроксида меди (11). В пробирке с раствором крахмала произошло восстановление гидроксида меди (11).Сахароза во второй пробирке подвергается гидролизу на глюкозу и фруктозу. Запишите ваши выводы и наблюдения.

Опыт №3

Действие фермента пепсина на белок.

Ход работы:

В одну пробирку прилейте 1.5мл раствора пепсина, а в другую 1.5мл предварительно прокипяченного пепсина. В ту и другую пробирки внесите небольшое количество фибрина и поставьте пробирки в водяную баню при 38-40^оС. Через 40-50 мин фибрин растворится, т.е. подвергнется ферментативному гидролизу до растворимых в воде пептидов. Пепсин гидролизует белок в оптимально кислотной среде.

Опыт №4

Действие фермента липазы на жиры молока.

Ход работы:

Налейте в две пробирки по 1мл молока. В одну пробирку добавьте 0.5мл панкреатина, а в другую – 0.5мл воды. Затем в обе пробирки добавьте по 2-3 капли фенолфталеина и несколько капель раствора карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски и поместите их в водяную баню при 38-40^оС на 20-25 мин. Запишите ваши выводы и наблюдения.

Заключение

Сказ о дележе наследства

Умирал старый араб. Все его богатство состояло из 17 прекрасных белых верблюдов. Он собрал своих сыновей и объявил им свою последнюю волю: «Мой старший сын, опора семьи, должен получить после моей смерти половину верблюдов. Среднему сыну я завещаю треть всех верблюдов. Но и мой младший, любимый сын должен получить свою долю — одну девятую часть стада».

Сказав это, старый араб умер. Похоронив отца, три брата стали делить верблюдов. Но исполнить волю отца они не смогли: невозможно было разделить 17 верблюдов ни пополам, ни на три части, ни на девять частей. Но тут через пустыню проходил дервиш. Бедный, как все ученые, он вел с собой черного облезлого верблюда, нагруженного книгами. Братья обратились к нему за помощью. И дервиш сказал: «Выполнить волю вашего отца очень просто. Я дарю вам моего верблюда, а вы попробуйте разделить наследство». У братьев оказалось 18 верблюдов, и все разрешилось. Старший сын получил половину верблюдов – 9, средний – треть стада – 6 и младший сын получил свою долю – двух верблюдов.
Но 9, 6 и 2 дают 17, и после дележа оказался лишний верблюд — старый облезлый верблюд ученого. И дервиш сказал: «Отдайте мне назад моего верблюда за то, что я помог разделить вам наследство, а то мне придется самому тащить книги через пустыню».
Вот этот черный верблюд и подобен ферменту. Он сделал возможным такой процесс, который без него был бы немыслим, а сам остался без изменений. Это действительно основное свойство ферментов, да и вообще всякого катализатора. Ферменты – это прежде всего катализаторы.

Выводы по работе:

1. Слюна – превосходный доступный объект для биохимического исследования.

2. На примере амилазы были рассмотрены разнообразные свойства ферментов.

3. При обработке крахмала ферментами слюны он разрушается, если ферменты активны.

4. Подтверждением того, что ферменты имеют белковую природу, служит отсутствие «вскипания» на поверхности вареного картофеля, так как при варке под влиянием высокой температуры происходит денатурация белков и ферменты, как и другие белки, теряют свою активность.

5. Глюкоза обладает восстановительными свойствами.

6. Фермент слюны разрушается при кипении.

7. Белки расщепляются под воздействием ферментов желудочного сока, которые действуют лишь при определенной температуре и в кислой среде.

8. Проявляется зависимость активности фермента от рН среды.

9. С повышением концентрации каталазы скорость реакции увеличивается.

10. Чем выше концентрация субстрата, тем активнее идет реакция.

Литература

1.Власова З.А. Биология. Справочник школьника.М.,Всероссийское слово, 1995 г.

2.Хомченко Г.Л. Химия для поступающих в ВУЗы. Учебное пособие. М., Высшая школа,1993 г.

3.Биологический энциклопедический словарь. Под ред. Гилярова М.С. М., Советская энциклопедия, 1987 г.

4.Крицман В.А.Энциклопедический словарь юного химика.М., Педагогика.1990 г.

5.Станцо В,В, Энциклопедический словарь юного биолога. М., Педагогика.1990 г.

6.Колесов Д.В.Биология. Человек. Учебник 8 класса 2006г

Приложение

ТЕМПЕРАТУРНЫЙ ОПТИМУМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Рис. 1

О

4 5 6 7 8 9 10

рН

оптимум рН

С

К

О

Р

О

С

Т

Ь

Р

Е

А

К

Ц

И

И

ПТИМУМ рН ФЕРМЕНТОВ

Рис. 2